Pewarnaan BTA (Bakteri Tahan Asam)

     Tata Cara Pewarnaan BTA

Tata Cara Pewarnaan BTA.

 Pemeriksaan BTA atau Bakteri Tahan Asam adalah pemeriksaan untuk mendeteksi bakteri yang bersifat tahan terhadap asam. Pemeriksaan BTA ini merupakan pemeriksaan yang spesifik untuk mendeteksi bakteri Mycobacterium tuberculosis dan juga untuk bakteri genus Mycobacterium lainnya. Salah satu cara atau metode yang digunakan adalah metode Ziehl Nielsen.

Tata Cara Pewarnaan BTA

1. Prinsip Kerja Pewarnaan BTA

• Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cas basic fukhsin. Pada waktu pencucian dengan asam alkohol warna larutan carbol fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari Methylen Blue.

2. Alat Yang digunakan

• Mikroskop
• Spirtus
• Objek Glass
• Rak Pengecatan
• Ose Bulat
• Pipet Pasteur

2. Reagensia Yang Digunakan

- Carbol Fuchsin 

• Basic Fuchsin 3.0 gr
• Etanol / Methanol 100 ml
• Kristal Phenol 45 gr
• Aquadest 900 ml

- Larutan Dekolorisasi

• HCl Pekat 30 ml
• Etanol 970 ml

- Pewarna Kontras

• Methylen Blue Chlorida 30 ml
• Aquadest 1000 ml

Tata Cara Pewarnaan BTA dan Pewarnaan Gram

Adapun Langkah-langkah Tata Cara Pewarnaan BTA sebagai berikut :

1. Mempersiapkan alat-alat yang diperlukan
2. Mempersiapkan reagensia yang akan digunakan
3. Membuat preparat / sediaan dari spesimen
4. Membuat apusan melingkar pada bagian tengah objek glass seukuran 2 x 3 cm.
5. Memberi etiket / no.register lab pada bagian pinggir objek glass
6. Memanaskan ose pada lampu spirtus sampai membara setelah setiap satu spesimen yang dikerjakan
7. Mengeringkan serta melakukan fiksasi preparat sebanyak 3 kali

Tahapan Tata Cara Pewarnaan BTA sebagai berikut :

1. Meletakkan preparat diatas rak pengecatan
2. Teteskan carbol fuchsin hingga mengenangi seluruh permukaan spesimen
3. Panaskan sediaan tersebut dengan menggunakan lampu spirtus sampai menguap tapi tidak mendidih 
4. Dinginkan sejenak selama 5 menit lalu cuci dengan menggunakan air mengalir
5. Teteskan larutan HCl untuk proses decolorisasi sampai tidak ada lagi pewarna carbol fuchsin selama 3 menit
6. Kemudian cuci kembali menggunakan air mengalir
7. Teteskan larutan Methylen Blue keseluruh permukaan preparat selama 30 detik sampai 1 menit
8. Mencuci kembali preparat tersebut dengan air mengalir kemudian preparat dikeringkan pada posisi miring di udara terbuka
9. Amati preparat tersebut dengan menggunakan mikroskop pada pembesaran 1000 kali untuk mendeteksi ada tidaknya bakteri tahan asam (BTA)
10. BTA Positif adalah bakteri batang berwarna merah

Penilaian Hasil Pemeriksaan BTA menut IUATLD sebagai berikut :

• Negatif  :  Tidak dutemukan BTA dalam 100 lapangan pandang
• Ditemukan 1-9 BTA / 100 lapangan pandang  : ditulis jumlah bakteri yang ditemukan
• Positif + (1+)  :  Ditemukan 10 - 99 BTA / 100 Lapangan Pandang
• Positif ++ (2+) : Ditemukan 1 - 10 BTA / 1 Lapangan Pandang
• Positif +++ (3+) : Ditemukan > 10 BTA / 1 Lapangan Pandang

PEMBAHASAN

Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997). Contoh dari bakteri tahan asam yaitu dari genus Mycobacterium. Bakteri ini memiliki sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relative tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau pewarnaan gram (Dwijoseputro, 1994).

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoaIsospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikanM. tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga (Thomas, 1999).

Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen. Bakteri ini mempunyai susunan dinding yang melindungi bakteri jika hidup di luar inangnya. Dinding sel mikobakteria menyebabkan penundaan hipersensitivitas dan beberapa diantaranya resisten terhadap infeksi. Sel mikrobakteria dapat menunda reaksi hipersensitifitas pada hewan yang sebelumnya sensitif. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida. (Mudihardi, 2005).

TBC (tuberculosis) adalah penyakit yang ditandai dengan timbulnya bintik-bintik tuberkel pada alveolus akibat infeksi bakteri Mycobacterium tuberculosis yang menyebabkan terganggunya difusi oksigen. Penyebab penyakit ini adalah bakteri kompleks Mycobacterium tuberculosis. Mycobacteria termasuk dalam famili Mycobacteriaceae dan termasuk dalam ordo Actinomycetales. Kompleks Mycobacterium tuberculosis meliputi M. tuberculosis, M. bovis,M. africanum, M. microti, dan M. canettii. Dari beberapa kompleks tersebut, M. tuberculosis merupakan jenis yang terpenting dan paling sering dijumpai (Thomas, 1999).  

Tubercolosis merupakan salah satu penyakit yang mematikan didunia selain AIDS bahkan merupakan penyebab utama kematian di negara berkembang. Oleh sebab itulah diperlukan suatu metode yang efektif untuk mencegah penularan yang lebih luas lagi dan penanganan yang tepat terhadap pasien yang positif terkena tuberculosis. Jumlah penderita TBC menurut WHO, Treatment of Tuberculosis, Guidelines for National Programes (1997), mencapai kira-kira 9 jt/tahun dengan kematian 3 juta orang. Penderita TBC sangat banyak di negara berkembang mencapai 95 % dengan 75% adalah penderita usia produktif (15-50 tahun) (Depkes RI, 2001).

Sumber penularan adalah penderita TBC yang dahaknya mengandung Mycobacterium tuberculosis. Infeksi bakteri ini paling sering disebarkan melalui udara (air borne, droplets infection). Penyebaran melalui udara berupa partikel-partikel percikan dahak yang mengandung bakteri berasal dari penderita saat batuk, bersin, tertawa, bernyanyi atau bicara. Partikel mengandung bakteri ini akan terhisap oleh orang sehat dan menimbulkan infeksi di saluran napas. Bakteri Mycobacterium tuberculosis mencemari udara yang ditinggali atau ditempati banyak manusia, karena sumber dari bakteri ini adalah manusia. Bakteri ini dapat hidup selama beberapa jam pada udara terbuka, dan selama itulah akan beterbangan di udara hingga akhirnya menemukan manusia sebagai tempat hidup (Clifton, 1958).

Menurut Chivers dan Ford (1978), gejala klinis TBC pada manusia  yang dapat diamati diantaranya:

-       Batuk-batuk berdahak lebih dari dua minggu, batuk berdarah atau pernah mengeluarkan darah, dada terasa sakit atau nyeri, terasa sesak pada waktu bernafas.

-       Berat badan turun selama 3 bulan berturut-turut tanpa sebab yang jelas dan tidak naik dalam 1 bulan meskipun sudah dengan penanganan gizi yang baik.

-       Nafsu makan tidak ada (anorexia) dengan gagal tumbuh dan berat badan tidak naik (failure to thrive).

-       Demam lama atau berulang tanpa sebab yang jelas, setelah disingkirkan kemungkinan penyebab lainnya (bukan tifus, malaria atau infeksi saluran nafas akut), dapat juga disertai keringat malam.

-       Gejala - gejala dari saluran nafas, misalnya batuk lama lebih dari 30 hari (setelah disingkirkan sebab lain dari batuk), nyeri dada ketika bernafas atau batuk.

-       Apabila bakteri TB menyebar ke organ-organ tubuh yang lain, gejala yang ditimbulkan akan berbeda-beda. Misalnya, kaku kuduk, muntah-muntah, dan kehilangan kesadaran pada TBC otak & saraf (meningitis TB).

-       Pembengkakan tulang pinggul, lutut, kaki dan tangan, pada TBC tulang & sendi.

Semua gejala yang ditimbulkan diatas sering berkaitan dengan patogenitas organisme, pejalanan penyakit, tingkat infeksi, dan beberapa faktor dari induk semang. Masa inkubasi tuberkulosis sangat lama, kejadiannya berlarut-larut, dan gejala klinis yang nyata jarang terlihat dengan jelas hingga penyakit ini berkembang lebih lanjut.

Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu optimal 37-38⁰C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif berisi  antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001).

Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO₂ meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).

Mikobakteria kaya akan lipid, bahan dari lilin dan fosfatida. Lapisan lilin pada dinding sel ini menyebabkan bakteri ini tahan terhadap keadaan di luar tubuh induk semang. Bakteri dapat tahan berbulan-bulan di luar tubuh induk semang, jika terbungkus eksudat, tinja, dalam cairan atau dalam jaringan organ tubuh yang membusuk. Dalam sel, lipid secara meluas berikatan dengan protein dan polisakarida. Muramil dipeptida (dari peptidoglikan) yang diperkaya dengan asam mikolat dapat menyebabkan nekrosis kaseosa. Lipid pada beberapa perluasan bertanggung jawab terhadap kecepatan asam, yang terganggu pada integritas dinding sel dan kehadiran lipid tertentu. Kecepatan asam juga hilang setelah sonikasi sel mikobakteria (Mudihardi, 2005).

Cara diagnosa penyakit TBC dengan menggunakan pendekatan mikrobiologis adalah dengan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA). Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) menggunakan beberapa teknik atau metode pewarnaan. Teknik pewarnaan tersebut antara lain Tan Thiam Hok (Kinyoun Gabber), Ziehl-Neelsen, dan Fluorokrom. Metode Ziehl-Neelsen merupakan pewarnaan standar untuk mengamati M. tuberculosis(Karuniawati et al.,2005).

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994).

Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsendapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :

1.      Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid fast).

2.      Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non acid fast).

Teknik pewarnaan Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabber) menggunakan larutan Kinyoun dan Gabber. Komposisi larutan Kinyoun yaitu fuchsin basis 4g, fenol 8ml, alkohol 95% 20ml, H₂O destilata (100ml) dan larutan gabbett yaitu methylen blue 1gr, H₂SO₄ 96 % 20 ml, alkohol absolut 30 ml, dan H₂O destilata 50 ml. Pewarnaan yang lain yaitu pewarnaan Fluorokrom (Auramine O). Sampel atau sediaan direndam dalam larutan Auramine (Merck) dan dibiarkan selama 15 menit lalu dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Setelah itu, sediaan tadi direndam dalam asam alkhohol, dibiarkan selama 2 menit dan dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Setelah kering sediaan direndam dalam poasium permanganat 0,5 %, dibiarkan selama 2 menit lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan di udara (Kurniawati et al., 2005).

Metode pewarnaan yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu Ziehl-Neelsen. Metode ini digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005).

Larutan kimia yang digunakan pada praktikum kali ini adalah alkohol asam 3% , carbol fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980).

Hasil praktikum kemarin diperoleh bahwa sputum yang diambil oleh kelompok 1 bernilai positif 2. Hal itu dikarenakan ditemukan bakteri basil berwarna merah berjumlah 2 buah dalam 1 LP dalam sediaan apus yang diamati di bawah mikroskop. Hal ini sesuai dengan standar yang terdapat dalam IUATLD (International Union Against Tuberculosis Lung Disease) seperti berikut :

-          Negatif      : Tidak dijumpai adanya BTA

-          Positif        : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP

-          Positif 1     : Ditemukan 10-99 BTA/100 LP

-          Positif 2     : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP

-          Positif 3     : Ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP

Berikut ini adalah gambar hasil praktikum yang menunjukkan adanya Mycobacterium tuberculosis.

                                                      Daftar Pustaka

http://www.tesdarahlengkap.com/2014/11/tata-cara-pewarnaan-bta.html

http://justzita.blogspot.co.id/2011/10/laporan-bakteriologi-bakteri-tahan-asam.html